تحليل البيانات العامة
تم الحصول على بيانات عن سلالات SARS-CoV-2 وتاريخ أخذ العينة من التسلسلات المتاحة من شيلي من موقع Consorcio Genomas CoV2 المتاح في https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. تم الحصول على بيانات التطعيم من البيانات العامة من وزارة العلوم والتكنولوجيا والمعرفة والابتكار المتاحة في https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (المنتج 83).
فحص العدوى
تم تحضير فيروسات النمط الكاذب التي تحمل بروتينات سارس- CoV-2 المختلفة كما وصفنا سابقًا12. باختصار ، تم إنتاج الأنماط الزائفة SARS-CoV-1 المستندة إلى HIV-2 في خلايا HEK293T عن طريق نقل pNL4.3-ΔEnv-Luc مع ناقل ترميز pCDNA-SARS-CoV-2 Spike المقابل في نسبة 1: 1 مولارية. ترميز البلازميدات ارتفاعًا مُحسَّنًا بالشفرة يفتقر إلى آخر 19 من الأحماض الأمينية للنهاية الطرفية C (SΔ19) المعروف بتجنب الاحتفاظ في الشبكة الإندوبلازمية12 تم الحصول عليها عن طريق التوليف الجيني أو الطفرات المخصصة الموجهة للموقع (GeneScript) واحتوت على الطفرات التالية: النسب A (التسلسل المرجعي) ، النسب B (D614G) ، النسب B.1.1.7 (Δ69-70 ، Δ144 ، N501Y ، A570D ، D614G ، P681H ، T716I ، S982A ، D1118H) ، النسب P.1 (L18F ، T20N ، P26S ، D138Y ، R190S ، K417T ، E484K ، N501Y ، D614G ، H655Y ، T1027I) والنسب C.37 (G75Δ76 ، T246) 252 ، L452Q ، F490S ، D614G ، T859N). تم مسح كل تحضير من النمط الكاذب عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وتم تحديد كمية باستخدام HIV-1 Gag p24 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems) ، مقسم في 50 ٪ من مصل بقري جنيني (Sigma-Aldrich) وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى استعمال. تم استخدام كميات مختلفة من فيروسات النمط الكاذب (على النحو الذي تحدده مستويات بروتين HIV-1 p24) لإصابة خلايا HEK-ACE2 وبعد 48 ساعة ، تم قياس نشاط لوسيفيراز اليراع باستخدام كاشف اختبار Luciferase (Promega) في صفيحة Glomax 96 Microplate مقياس اللمعان (بروميغا).
مقايسة التحييد
تم إجراء فحوصات تحييد فيروس النمط الكاذب بشكل أساسي كما وصفنا سابقًا12. باختصار ، تم تحضير التخفيفات التسلسلية لعينات البلازما (1: 4 إلى 1: 8748) في DMEM مع 10 ٪ من مصل الأبقار الجنيني واحتضانها بـ 5 نانوغرام من p24 من كل فيروس نمطي كاذب خلال ساعة واحدة عند 1 درجة مئوية ثم 37 × 14 تمت إضافة من خلايا HEK-ACE2 إلى كل بئر. تم استخدام خلايا HEK293T (لا تعبر عن ACE2) المحتضنة بفيروس النمط الكاذب (النسب A) كعنصر تحكم سلبي. تم تحليل الخلايا بعد 48 ساعة ، وتم قياس نشاط لوسيفيراز اليراع باستخدام كاشف اختبار Luciferase (Promega) في مقياس الإنارة Glomax 96 Microplate (Promega). تم حساب النسبة المئوية للتحييد لكل تخفيف وتم حساب ID50 لكل عينة باستخدام إصدار GraphPad Prism 9.0.1.
تحاليل احصائية
تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام الإصدار 9.1.2 من برنامج GraphPad Prism. تم إجراء مقارنات جماعية متعددة لتحييد عيار الأجسام المضادة (NAbTs) مقابل لوحة من فيروسات النمط الكاذب لـ SARS-CoV-2 بالإضافة إلى مقارنات بين استجابات NAbs حسب الجنس وحالة الدخان باستخدام زوج من اختبار Wilcoxon المصنف. تم حساب تغير العامل على أنه اختلاف عيار المتوسط الهندسي في المعرف50 بالمقارنة مع فيروس النمط الكاذب من النوع البري. تم إجراء تحليل الارتباط بين NAbTs والعمر أو مؤشر كتلة الجسم باستخدام اختبار سبيرمان. تم إجراء اختبار المقارنة المتعددة ANOVA و Tukey أحادي الاتجاه للتحليل الإحصائي للعدوى. اعتبرت قيمة p ≤0.05 ذات دلالة إحصائية.
الموافقة الأخلاقية
تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بكلية الطب بجامعة تشيلي (المشروعان رقم 0361-2021 ورقم 096-2020) و Clínica Santa Maria (المشروع رقم 132604-21). وقع جميع المانحين على الموافقة المستنيرة ، وتم إخفاء هوية عيناتهم.
تأثير طفرات السنبلة في متغير لامدا على العدوى وتحييد استجابات الأجسام المضادة
تحليل 3695 تسلسل من شيلي المودعة في GISAID حسب 24 يونيوth يُظهر عام 2021 هيمنة واضحة لمتغيرات SARS-CoV-2 Gamma و Lambda خلال الفصل الأخير من الحمل ، معًا ، لـ 79 ٪ من جميع التسلسلات.
ومن المثير للاهتمام أن هذه الفترة تميزت بحملة تطعيم واسعة النطاق حيث تلقى 65.6٪ من السكان المستهدفين (18 عامًا فأكثر) خطة تطعيم كاملة اعتبارًا من 27 يونيو.th 2021
بالنظر إلى أن 78.2٪ من الأشخاص الذين تم تلقيحهم بمخطط كامل تلقوا لقاح الفيروس المعطل CoronaVac من Sinovac Biotech ، فقد سعينا إلى التحقيق في تأثير الطفرات المرتفعة الموجودة في متغير Lambda على قدرة تحييد الأجسام المضادة التي ينتجها هذا اللقاح.
لهذا ، أنشأنا فيروسات النمط الكاذب المستندة إلى فيروس HIV-1 المستندة إلى SARS-CoV-2 والتي تحمل البروتين السنبلة من سلالة ووهان 1 المرجعية (النوع البري ؛ النسب أ) ، طفرة D614G (النسب ب) ، والألفا (النسب ب). .1.1.7) ، متغيرات Gamma (النسب P.1) و Lambda (النسب C.37).
أثناء تحضير الفيروس ، لاحظنا باستمرار أن الخلايا المصابة بفيروس النمط الكاذب التي تحمل ارتفاع Lambda أنتجت قيم تلألؤ بيولوجي أعلى بشكل ملحوظ عند مقارنتها بمتغير D614G أو متغيرات Alpha و Gamma التي تشير إلى زيادة العدوى الناتجة عن بروتين Lambda spike.
الرقم 1.العدوى بوساطة بروتينات سبايك مختلفة.
(أ) تمثيل تخطيطي لبروتين ارتفاع SARS-CoV-2 والمتغيرات المستخدمة في هذه الدراسة. يشار إلى الأنساب بين قوسين. RBD ، مجال ربط المستقبلات ، CM ؛ الذيل السيتوبلازمي.
(ب) معايرة الأنماط الزائفة لكل سلالة باستخدام كميات مكافئة من HIV-1 p24. تم قياس نشاط لوسيفيراز اليراع كوحدات تلألؤ نسبي (RLU) بعد 48 ساعة من الإصابة. تم حساب المتوسط و SD من تجربة ثلاثية تمثيلية.
بعد ذلك ، استخدمنا فيروسات النمط الكاذب المذكورة أعلاه لإجراء فحوصات التعادل باستخدام 79 عينة بلازما من العاملين الصحيين في الرعاية الصحية من Universidad de Chile و Clínica Santa María في سانتياغو ، تشيلي.
استبعدنا 4 عينات لأننا لم نتمكن من حساب عيار ID50. من العينات التي تم تحليلها ، فإن 73٪ تتوافق مع النساء ، ومتوسط العمر 34 عامًا (معدل الذكاء 29-43) ومؤشر أقصى للجسم (BMI) يبلغ 25 (معدل الذكاء 22.7 - 27). صرح 20.5٪ من المشاركين بأنهم مدخنون نشطون خلال فترة التحصين. تم الحصول على العينات في متوسط 95 يومًا (معدل الذكاء 76-96) بعد الجرعة الثانية من لقاح CoronaVac
لاحظنا أن تحييد فيروس النمط الكاذب الذي يحمل بروتين سبايك من النوع البري أدى إلى تخفيف مثبط بنسبة 50٪ (ID50) متوسط عيار 191.46 (154.9 - 227.95 ، 95٪ CI ،) ، بينما كان 153.92 (115.68 - 192.16 ، 95٪ CI) ، 124.73 (86.2 - 163.2 ، 95٪ CI) ، 104.57 (75.02 - 134.11 ، 95٪ CI) ) و 78.75 (49.8 - 107.6 ، 95٪ CI) لفيروسات النمط الكاذب التي تحمل بروتين سبايك من متحولة D614G أو متغيرات Alpha و Gamma و Lambda ، على التوالي.
لاحظنا أيضًا أن العيار المتوسط الهندسي للمعرف50 انخفض التتر بعامل 3.05 (2.57 - 3.61 ، 95٪ CI) لفيروس النمط الكاذب الذي يحمل ارتفاع Lambda ، 2.33 (1.95 - 2.80 ، 95٪ CI) لارتفاع جاما ، 2.03 (1.71 - 2.41 ، 95٪ CI) لارتفاع Alpha و 1.37 (1.20 - 1.55 ، 95٪ CI) لارتفاع D614G عند مقارنته بالارتفاع من النوع Wild.
لم يلاحظ أي ارتباط بين الجنس والعمر ومؤشر كتلة الجسم (BMI) أو حالة الدخان وتحييد عيار الأجسام المضادة في مجموعة دراستنا.
الرقم 2.مقايسة التحييد باستخدام عينات بلازما مأخوذة من لقاحات CoronaVac
(أ) التغييرات في عيار التحييد المتبادل 50٪ (ID50) في عينات البلازما من 75 متلقيًا للقاح CoronaVac ضد D614G (النسب B) ، Alpha (النسب B.1.1.7) ،
متغيرات جاما (النسب P.1) و Lambda (النسب C.37) مقارنة بالفيروسات البرية. تظهر النتائج على أنها الفرق في عيارات التعادل للعينات المتطابقة. قيم P لمقارنة المعرف50 يتم حسابها باستخدام اختبار تصنيف موقع ويلكوكسون.
(ب) المخططات الصندوقية أشارت إلى المدى المتوسط والربعي (IQR) للمعرف50 لكل فيروس من النمط الكاذب. تظهر تغييرات العامل على أنها اختلاف عيار المتوسط الهندسي في المعرف50 بالمقارنة مع تلك الخاصة بالفيروس الكاذب من النوع البري. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار تصنيف موقع ويلكوكسون للأزواج المتطابقة.
كشفت بياناتنا معًا أن بروتين السنبلة لمتغير Lambda المعترف به حديثًا ، والذي ينتشر بشكل كبير في تشيلي ودول أمريكا الجنوبية ، يحمل طفرات تمنح زيادة في العدوى والقدرة على الهروب من الأجسام المضادة المعادلة التي أثارها CoronaVac.
